Kit Uji Anti Tiroid Peroksidase Elisa Kit Uji Antibodi TPO

Kit Elisa Anti-TPO Anti-Tiroid Peroksidase

1. Tujuan penggunaan

Immunoassay untuk penentuan kuantitatif in vitro antibodi terhadap peroksidase tiroid dalam serum manusia.Penentuan anti-TPO digunakan sebagai bantuan dalam diagnosis penyakit tiroid autoimun.

2. Ringkasan 

• Peroksidase spesifik tiroid (TPO) hadir pada mikrosom tirosit dan diekspresikan pada permukaan sel apikalnya.Bersinergi dengan tiroglobulin (Tg) enzim ini memiliki fungsi penting dalam iodinasi L-tirosin dan penggabungan kimia dari mono- dan di-iodotirosin yang dihasilkan untuk membentuk hormon tiroid T4, T3, dan fT3.
• TPO adalah autoantigen potensial.Peningkatan titer serum antibodi terhadap TPO ditemukan pada beberapa bentuk tiroiditis yang disebabkan oleh autoimunitas.Istilah “antibodi mikrosomal” yang masih sering ditemukan berasal dari saat TPO belum diidentifikasi sebagai antigen dalam autoimunitas yang disebabkan oleh mikrosom.Dalam pengertian klinis, dua istilah anti-TPO dan antibodi mikrosomal dapat digunakan secara sinonim;ada perbedaan, bagaimanapun, berkaitan dengan metode pengujian.
• Titer anti-TPO yang tinggi ditemukan pada 90% pasien dengan tiroiditis Hashimoto kronis.Pada penyakit Graves, 70% pasien mengalami peningkatan titer.Meskipun sensitivitas prosedur dapat ditingkatkan dengan secara simultan menentukan antibodi tiroid lainnya (anti-Tg, TSH-reseptor-antibodi - TRAb), temuan negatif tidak mengesampingkan kemungkinan penyakit autoimun.Besarnya titer antibodi tidak berkorelasi dengan aktivitas klinis penyakit.Awalnya peningkatan titer dapat menjadi negatif setelah lama sakit atau selama remisi.Jika antibodi muncul kembali setelah remisi, maka kemungkinan kambuh.
• Sedangkan tes antibodi mikrosomal biasa menggunakan mikrosom yang tidak dimurnikan sebagai persiapan antigen, tes anti-TPO menggunakan peroksidase yang dimurnikan.Kedua prosedur tersebut memiliki kinerja yang sebanding dalam hal sensitivitas klinis, tetapi konsistensi lot-to-lot yang lebih baik dan spesifisitas klinis yang lebih tinggi dapat diharapkan dari tes anti-TPO karena kualitas antigen yang digunakan lebih tinggi.Tes imunosorben terkait enzim menggunakan antigen manusia dan antibodi IgG anti-manusia kelinci (anti-IgG).

3. Prinsip pengujian

Metode tidak langsung, total durasi pengujian: 70 menit.

ELISA Anti-TPO menggunakan fase padat, metode ELISA tidak langsung untuk mendeteksi antibodi terhadap TPO dalam prosedur inkubasi dua langkah.Strip microwell polystyrene dilapisi dengan antigen TPO manusia yang sangat imunoreaktif.Selama langkah inkubasi pertama, antibodi spesifik anti-TPO, jika ada, akan terikat pada antigen TPO fase padat yang telah dilapisi sebelumnya.Sumur dicuci untuk menghilangkan protein serum yang tidak terikat, dan antibodi IgG anti-manusia kelinci (anti-IgG) yang terkonjugasi dengan enzim horseradish peroxidase (HRP-Conjugate) ditambahkan.Selama langkah inkubasi kedua, antibodi terkonjugasi HRP ini akan terikat pada kompleks antigen-antibodi (IgG) yang sebelumnya terbentuk dan konjugat HRP yang tidak terikat kemudian dihilangkan dengan pencucian.Larutan kromogen yang mengandung Tetramethylbenzidine (TMB) dan urea peroksida ditambahkan ke sumur dan dengan adanya imunokompleks antigen-antibodi-anti-IgG (HRP), kromogen yang tidak berwarna dihidrolisis oleh konjugat HRP yang terikat menjadi produk berwarna biru.Warna biru berubah menjadi kuning setelah menghentikan reaksi dengan asam sulfat.

Jumlah intensitas warna dapat diukur dan sebanding dengan jumlah antibodi yang ditangkap di sumur, dan jumlah antibodi dalam sampel masing-masing.

4. Bahan Reagen disediakan

• Microplate Dilapisi, 8 x 12 strip, 96 sumur.Pra-dilapisi dengan antigen TPO manusia.

• Kalibrator, 6 vial, masing-masing 1 mL, siap pakai;Konsentrasi: 0(A), 25(B), 50(C), 100(D), 250(E) dan 500(F) IU/mL.

• Enzyme Conjugate, 1 vial, 11,0 mL HRP (horseradish peroxidase) berlabel antibodi IgG anti-manusia kelinci (anti-IgG) kelinci dalam buffer Tris-NaCl yang mengandung BSA (bovine serum albumin).Mengandung 0,1% ProClin300 pengawet.

• Pengencer Serum: 1 vial, 11mL.Mengandung garam penyangga dan pewarna

• Konsentrat Larutan Cuci, 1 vial, 25 ml (konsentrat 40X), larutan pencuci PBS-Tween.

• Substrat, 1 vial, 11ml, siap pakai, (tetramethylbenzidine) TMB.

• Stop Solution, 1 vial, 6,0 ml 1 mol/l asam sulfat.

• IFU, 1 salinan.

• Tutup Piring : 2 buah.

Bahan yang dibutuhkan (tetapi tidak disediakan)

• Pembaca pelat mikro dengan kemampuan penyerap panjang gelombang 450nm dan 620nm.

• Mesin cuci piring mikro.

• Inkubator.

• Pengocok piring.

• Mikropipet dan mikropipet multisaluran menghasilkan 50µl dengan presisi lebih baik dari 1,5%.

• Kertas penyerap.

• Air sulingan

5. Prosedur pengujian

• Gunakan hanya jumlah sumur yang diperlukan dan format sumur pelat mikro untuk setiap kalibrator dan sampel yang akan diuji.

• Tambahkan 100 L kalibrator ke setiap sumur.

• Tambahkan 100 L Sample Diluent (Warna Hijau) ke setiap sumur Kecuali Kalibrator-sumur.

• Tambahkan 10 L Sample ke masing-masing Sample Diluent well (CATATAN: Reagen di Wells akan berubah warna menjadi Biru dari Hijau), lalu kocok selama 30 detik.

• Tutup piring dengan penutup piring dan inkubasi pada suhu 37 °C selama 30 menit.

• Buang isi piring mikro dengan dekantasi atau aspirasi.Jika menuang, ketuk dan keringkan pelat dengan kertas penyerap.

• Tambahkan 350 L larutan pencuci, tuang (ketuk dan blot) atau aspirasi.Ulangi 4 kali tambahan untuk total 5 kali pencucian.Di akhir pencucian, balikkan piring dan tepuk sisa larutan pencuci ke kertas penyerap.

• Tambahkan 100 L enzim konjugat,

• Tutup piring dengan penutup piring dan inkubasi pada suhu 37 °C selama 30 menit.

• Tambahkan 350 L larutan pencuci, tuang (ketuk dan blot) atau aspirasi.Ulangi 4 kali tambahan untuk total 5 kali pencucian.Di akhir pencucian, balikkan piring dan tepuk sisa larutan pencuci ke kertas penyerap.

• Tambahkan 100 L Substrat ke setiap sumur.Tutup dan inkubasi pada suhu sekitar (18-25 ) dalam gelap untuk reaksi selama 10 menit.Jangan goyangkan pelat setelah penambahan substrat.

• Tambahkan 50 L stop solution ke setiap sumur.

• Kocok selama 15-20 detik untuk mencampur cairan di dalam sumur.Penting untuk memastikan bahwa warna biru berubah menjadi kuning sepenuhnya.

• Baca absorbansi masing-masing sumur pada 450 nm ( menggunakan 620 hingga 630 nm sebagai panjang gelombang referensi untuk meminimalkan ketidaksempurnaan sumur) dalam pembaca pelat mikro.Hasilnya harus dibaca dalam waktu 30 menit setelah menambahkan stop solution.